蛋白质质谱分析具体流程
质谱技术在蛋白质组学中的应用
王海龙杨静祁振国岳秀兰
(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)
中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通
过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白
质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控
制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·
pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell Map
Pmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量
图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整
体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其
它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志
和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质
复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质
相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基
因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)
的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将
高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长
的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋
白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。
这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。
收稿日期：2006-03-02
作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。
l 质谱技术的发展历史
1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson
创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台
速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。
最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，
随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范
围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应
用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析
的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶
金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及
生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命
科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形
成了独特的生物质谱技术。
1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原
子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。
质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电
场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与
否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪
器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组
成 。
用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同
质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加
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232 包头医学院学报 第22卷
速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场
和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过
电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角
速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速
度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们
的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生
质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的
离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同
的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检
测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分
析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中
同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。
2 质谱技术种类
2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一
高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化
成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强
度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷
的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进
入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子
而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析
仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分
析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电
荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多
种分离技术联合使用 j。
2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将
分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射
晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量
蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分
析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为
单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的
质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行
时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足
够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质
谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快
速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅
出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定
的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。
FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定
样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术
的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而
使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。
2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的
技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应
用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就
想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含
量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱
在医学领域的应用开辟了一条思路。
3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定
电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内
切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：
3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广
泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行
切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改
进后的Wilm的方法。
将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切
下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管
内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒
5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O
一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去
乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加
热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的
10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心
管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的
100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的
巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小
时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。
3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝
胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．
O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结
合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无
SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极
性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白
质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分
析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是
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第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233
所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白
质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效
率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。
3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有
胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程
中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹
过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可
用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹
过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。
4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质
蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定
电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学
中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能
进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。
肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析
时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的
质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽
混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并
对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，
质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理
论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。
随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特
别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。
质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究
成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对
生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未
有新高度。
参考文献
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请教蛋白质谱鉴定数据分析问题
蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。一般说，蛋白质约占人体全部质量的18%，最重要的还是其与生命现象有关。[1-2]
蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
中文名
蛋白质
英文名
protein
别 称
朊
分子量
平均每个氨基酸为100
组 成
20多种氨基酸
旧 称
“朊（ruǎn)”
结 构
一级-四级
形成方式
脱水缩合
目录
1基本含义
2相关计算
▪ 原子数
▪ 分子质量
▪ 基因控制
3组成及特点
▪ 整体结构
▪ 检测方法
4生理需要
5代谢吸收
6病症
▪ 过量
▪ 缺乏症
7用处
8性质
▪ 两性
▪ 水解反应
▪ 胶体性质
▪ 沉淀
▪ 变性
▪ 颜色反应
▪ 气味反应
▪ 折叠
9生理功能
▪ 构造人的身体
▪ 结构物质
▪ 载体的运输
▪ 抗体的免疫
▪ 酶的催化
▪ 激素的调节
▪ 胶原蛋白
▪ 能源物质
10发展历程
11分类信息
▪ 需求情况分类
▪ 外形分类
▪ 结构种类
▪ 来源
12食用量
13相关研究
14相关学科
15食物含量
▪ 活性
▪ 功能
16主要研究
▪ 历史
▪ 研究方法
▪ 抗癌作用
▪ 组学
▪ 与身高的关系
17补充须知
▪ 计算需要量
▪ 分娩后补充
▪ 健身人群补充
18网络语言应用
1基本含义
蛋白质四聚体(四级结构)
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。
蛋白质中一定含有碳、氢、氧、氮元素。
蛋白质是由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。[3]
男性缺失蛋白质比女性缺失蛋白质更需要重视，男士一旦缺失蛋白质，会导致男性精子质量下降，精子活力降低以及精子不液化造成男性不育。
蛋白质是一种复杂的有机化合物，旧称“朊（ruǎn)”。
氨基酸结构通式
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合连成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基（-R）不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种基本氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质可以一起，往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，折叠或螺旋构成一定的空间结构，从而发挥某一特定功能。合成多肽的细胞器是细胞质中糙面型内质网上的核糖体。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类、数目、排列顺序和肽链空间结构的不同。
食入的蛋白质在体内经过消化被水解成氨基酸被吸收后，合成人体所需蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。因此，食物蛋白质的质和量、各种氨基酸的比例，关系到人体蛋白质合成的量，尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿，都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系。蛋白质又分为完全蛋白质和不完全蛋白质。富含必需氨基酸，品质优良的蛋白质统称完全蛋白质，如奶、蛋、鱼、肉类等属于完全蛋白质，植物中的大豆亦含有完全蛋白质。缺乏必需氨基酸或者含量很少的蛋白质称不完全蛋白质，如谷、麦类、玉米所含的蛋白质和动物皮骨中的明胶等。
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