什么是层析柱？
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱，具体原理和方法如下：柱层析原理：柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。柱层析分离的注意事项装柱子时从下往上装，先塞棉花，这个主要是为了不漏石英砂和硅胶。然后倒入石英砂，到图示那么多就可以了，主要是为了填补柱子下面的空间，让硅胶柱是一个上下面粗细一致的圆柱形。装柱子过程不在这里赘述，装好柱子后，上样品，注意用吸管小心翼翼，沿着柱壁绕圈，均匀上样，尽量不要弄坏硅胶表面。样品倒入后，让样品靠重力完全渗入硅胶，最后再随意倒入一些石英砂在最上面。这主要是为了保护已经上样完成的硅胶表面，这样以后再倒溶剂时，就不用担心破坏上层硅胶表面的平整了。
层析柱原理和使用方法
柱层析技术又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。柱层析操作时，先在圆柱管中填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。装柱方法湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂走柱子，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂走柱子，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
柱层析的基本操作过程+1、装柱2、(+)3、加样4、洗脱5、收集
1．装柱取一支洁净干燥的层析柱玻管，自柱口塞入少许脱脂棉并用长玻棒推至柱底压平（塞时不宜太紧）。然后用漏斗从柱口小心装入约5g硅胶（100~160目）（四分之三高度，干法装柱），边装边用手指敲打层析柱，使填装紧密均匀。再在柱顶加入一薄层脱脂棉花（约0.5cm厚）。将此层析柱固定在铁架台上。
2．加样称取研磨研细的菠菜叶2.0~3.0g于25mL烧杯中，量取10mL石油醚：丙酮=1:1（体积比）的混合液溶解浸泡，用封口薄膜封住杯口，浸泡10min,倒出浸出液静置分层，用刻度胶头滴管吸取1.0mL上样分析，注意上样应沿管壁。（注意：胶头刻度滴管应是干燥的）
3．洗脱、分离慢慢加入石油醚：丙酮=95:5（体积比）的洗脱液约10mL洗脱，在柱上可以看到黄色的色带。再继续加石油醚：丙酮=2:8（体积比）的洗脱液约10mL洗脱，在柱上可以看到绿色的色带。【摘要】
柱层析的基本操作过程+1、装柱2、(+)3、加样4、洗脱5、收集【提问】
1．装柱取一支洁净干燥的层析柱玻管，自柱口塞入少许脱脂棉并用长玻棒推至柱底压平（塞时不宜太紧）。然后用漏斗从柱口小心装入约5g硅胶（100~160目）（四分之三高度，干法装柱），边装边用手指敲打层析柱，使填装紧密均匀。再在柱顶加入一薄层脱脂棉花（约0.5cm厚）。将此层析柱固定在铁架台上。
2．加样称取研磨研细的菠菜叶2.0~3.0g于25mL烧杯中，量取10mL石油醚：丙酮=1:1（体积比）的混合液溶解浸泡，用封口薄膜封住杯口，浸泡10min,倒出浸出液静置分层，用刻度胶头滴管吸取1.0mL上样分析，注意上样应沿管壁。（注意：胶头刻度滴管应是干燥的）
3．洗脱、分离慢慢加入石油醚：丙酮=95:5（体积比）的洗脱液约10mL洗脱，在柱上可以看到黄色的色带。再继续加石油醚：丙酮=2:8（体积比）的洗脱液约10mL洗脱，在柱上可以看到绿色的色带。【回答】
柱层析原理
柱层析分离，也叫柱色谱，具体原理和方法如下：柱层析原理：柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。柱层析分离的注意事项装柱子时从下往上装，先塞棉花，这个主要是为了不漏石英砂和硅胶。然后倒入石英砂，到图示那么多就可以了，主要是为了填补柱子下面的空间，让硅胶柱是一个上下面粗细一致的圆柱形。装柱子过程不在这里赘述，装好柱子后，上样品，注意用吸管小心翼翼，沿着柱壁绕圈，均匀上样，尽量不要弄坏硅胶表面。样品倒入后，让样品靠重力完全渗入硅胶，最后再随意倒入一些石英砂在最上面。这主要是为了保护已经上样完成的硅胶表面，这样以后再倒溶剂时，就不用担心破坏上层硅胶表面的平整了。
5．举例说明三种柱层析的原理
在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 二、 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 三、 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 四、 亲和层析 亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰（见图6－2）。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。 上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 五、 聚焦层析 聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为 多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。 聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 1、PH梯度溶液的形成 在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室（这层析柱者）中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液（配方见表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。 2．蛋白质的行为 蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。 不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。
层析柱如何来选择，玻璃层析柱与和加压层析柱的优缺点各是什么
层析柱是凝胶层析技术中的主体，我们研究所用的就是同兴玻璃仪器，一般用玻璃管或有机玻璃管。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，从而分离的一种层析法。
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，
直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。
玻璃层析柱，开口大，加料快，不需要其他仪器的配合，上方可以做成标准口与其他的标口玻璃仪器相接，但有不容易测量，筛网下方容易残留很多液体，层析速度较慢，不准确的特点，一般用于对精度要求没有那么高的实验，
加压层析柱，两端一般使用4F材料，耐腐蚀，酸碱性的耐度也可以，中段有玻璃材料的，也有有机玻璃材料的，需要与蠕动泵相结合，加快层析速度，用泵将料打进，如果没有泵则使用比较麻烦。现在一般的实验室都是使用加压的层析柱，taobao上有卖的。
